Clonaje, expresión y toxicidad de un gen tóxico de Bacillus thuringiensis subsp. medellin

Resumen

Bacillus thuringiensis (Bt) subsp. medellin (Btmed) produce inclusiones paraesporales cristalinas las cuales son tóxicas a larvas de mosquito. Se ha demostrado que las inclusio­nes de esta bacteria contienen, principalmen­te, proteíná de 94, 68 y 28-30 kDa. ADN total de Btmed, parcialmente digerido con la enzima EcoRI, fue clonado utilizando el kit de clonaje Lambda Zap II. Las placas recombinantes fueron analizadas con un anti­cuerpo policlonal producido en ratón contra la proteína del cristal de 94 kDa de Btmed. Una de las placas positivas fue seleccionada y, por excisión in vivo, se obtuvo pBluescript SK(-) recombinante. El gen que codifica la proteína tóxica de 94 kDa de Btmed fue donado en un fragmento de ADN de 4.4 kb. El ADN de Btmed luego fue subclonado como un fragmento EcoRI/EcoRI en el vector bifuncional pBU4, produciendo el plásmido recombinante pBTM3 y utilizado para trans­formar, por electroporación, la cepa cristal negativa 4Q2-81 de Bt subsp. israelensis (Bti). La toxicidad a larvas de mosquito fue estimada utilizando larvas de primer estadio de Aedes aegypti y Culex quinquefasciatus criadas en el laboratorio retadas con cristales completos. Los resultados de toxicidad indi­can que las inclusiones purificadas de la cepa de Bti recombinante son tóxicas a todas las especies de mosquitos analizadas, aunque la toxicidad no fue tan alta como la producida por el cristal de la cepa nativa de Btmed. La electroforesis en gel de poliacrylamida (SDS­PAGE) reveló que las inclusiones producidas por la cepa recombinante Bti (pBTM3) están principalmente compuestas de la proteína de 94 kDa del cristal de Btmed como fue deter­minado por Western blot.